重新认识土壤有机质
作者：沃土初论公号
2024/6/12 14:46:28
以腐殖质为主要成分的土壤有机质占土壤固相组成的2%~8%，是土壤中养分元素的承载者、微生物活动的驱动者以及矿质转化的调节者，对于土壤功能的发挥起着关键作用。在19世纪初,德国土壤学者Döbereiner和Sprengel就提出“humic acids”概念。有学者利用碱提取和酸沉淀的方法将土壤有机质分成富里酸、胡敏酸以及高度缩合、惰性的胡敏素等不同组分。随后，基于不同类型植
以腐殖质为主要成分的土壤有机质占土壤固相组成的2%~8%，是土壤中养分元素的承载者、微生物活动的驱动者以及矿质转化的调节者，对于土壤功能的发挥起着关键作用。在19世纪初, 德国土壤学者Döbereiner和Sprengel就提出“humic acids”概念。有学者利用碱提取和酸沉淀的方法将土壤有机质分成富里酸、胡敏酸以及高度缩合、惰性的胡敏素等不同组分。随后， 基于不同类型植物残体的培养研究, 发现木质素分解与腐殖酸积累显著相关, 由此提出了腐殖质的木质素形成理论, 认为土壤有机质主要来自于植物残体. 1994年, Stevenson总结了腐殖质的定义, 指出腐殖质是未指明、转化的、深色、不均匀、无定形的高分子物质,成为几十年来土壤学及相关学科对腐殖质分子结构认识的主流观点。腐殖质形成过程和木质素来源理论， 近年来得到了13C核磁共振和高分辨质谱证据的支持。现代分析技术的进步有力推动了土壤有机质的研究。21世纪初， Lehmann等人和Myneni等人利用扫描透射X射线显微技术对土壤有机质原位分析，发现土壤有机质分子组成复杂，在纳米尺度上存在异质性，暗示土壤中可能并不存在所谓的“腐殖质”大分子。此外，扫描电子显微镜在土壤颗粒表面观察到大量微生物残体，1H核磁共振也指出腐殖质主要由微生物来源的生物分子组成。基于这些实验证据，Lehmann和Kleber提出了土壤有机质连续体的概念模型。他们认为土壤有机质只存在连续分解的过程，有机质的稳定不受分子结构控制，而受矿物吸附、团聚作用的影响。这一学说向传统腐殖质理论发起了挑战，认为碱提取的土壤芳香化合物可能是人为操作产物。这一观点的提出促使人们重新审视土壤有机质的来源和结构，对土壤有机质本质的认识也逐渐从笼统的腐殖质大分子向明确的植物、微生物残体过渡。传统的土壤有机质理论认为，动植物残体分解过程中形成的小分子物质，能够在酶或矿物作用下缩合，形成聚合程度更高的高分子化合物—腐殖质。土壤中小分子有机化合物的聚合过程主要受真菌的驱动，在胞外酶催化下形成酚自由基和醌，进一步与其他酚类及氨基酸类物质中的NH2 –和SH–通过亲核反应聚合，或通过氢键与醌类物质结合形成更稳定的芳香结构含氮化合物。酚氧化酶、漆酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶等参与的反应可能形成了腐殖质的前驱物，这些前驱物与植物源残体的结构截然不同。聚酮合成酶可进一步催化土壤可溶性小分子形成多酮类聚合物，目前已知明确结构的多酮类聚合物多达100000个。此外，土壤黏粒矿物，尤其是铁、锰等金属氧化物，也可通过催化亲核加成反应或形成自由基，促进有机分子的聚合。这些反应可能是土壤腐殖质形成的重要潜在机制。基于13C-NMR的研究提供了更多土壤腐殖质的证据。将传统碱和酸分离得到的富里酸、胡敏酸和胡敏素重新混合，13C-NMR分析发现混合产物与未处理的土壤有机碳结构相同, 证明了传统的碱浸提方法不会改变土壤有机碳的官能团组成，表明土壤腐殖质并非提取过程人为造成的产物。对丹麦3种不同类型土壤28种腐殖质的元素组成及液态13C-NMR的分析发现，氨基酸和糖类物质普遍存在于自然土壤中。这一证据支持了木质素残体-氨基酸共价键结合形成土壤腐殖质的反应模型。此外，利用13C-NMR发现土壤腐殖质中存在大量的芳基酮、非质子化烷基和丰富的羧基碳，这些结构与未分解的生物残体存在显著的区别。上述结果表明，植物、微生物残体的分解产物可进一步参与腐殖化过程。高分辨离子回旋共振质谱( FT-ICR-MS)可以直接提供腐殖质分子的化学多样性信息。研究发现，土壤胡敏酸中脂类和稠合芳烃类物质的比例高于可溶性有机质(DOM)；而随腐殖化程度的增加，腐殖质中木质素类物质含量降低。进一步对不同水分条件土壤中的胡敏酸分析，发现它们都由木质素类、含羧基的脂环族类与缩合芳香族3种主要分子组成，分别占质谱识别分子数的38%、41%和26%。这些丰富的木质素和缩合芳香结构证明木质素与腐殖质存在密切的关联。此外，对西班牙35个土壤中有机分子丰度、有机碳含量的偏回归分析发现，土壤有机碳累积与木质素衍生物及不饱和脂类物质含量显著正相关。这些研究从有机质分子组成的角度支持了腐殖质的木质素起源学说。长期以来，土壤学家认为，土壤有机质是由植物残体在土壤微生物的分解、合成作用下形成，微生物推动着植物来源的有机质在土壤中的循环和转化。基于土壤微生物生物量碳仅占土壤总有机碳的5%以下，过去主流的观点普遍认为，植物来源的有机质主导了土壤碳库的组成。但是，土壤有机质的来源一直存在很大的不确定性。在1925年，Waksman指出了土壤腐殖质的微生物来源本质。近年来，越来越多的研究显示，微生物对土壤有机质积累的作用和贡献被极大地低估。吸收马尔科夫链计算表明，土壤微生物残体的有机碳储量可高达活体有机碳的40倍。利用氨基糖生物标志物计算发现，温带地区草地、农田和林地土壤微生物源碳占土壤总有机碳的比例分别为62%、56%和33%。最近，对60多个土壤总氨基糖的数据总结发现, 微生物源碳在大团聚体中较多，占总有机碳的47.2%，而在粉黏粒中为38.6%。Miltner等人利用扫描电子显微镜，在土壤颗粒表面原位观察到大量微生物残体碳的存在。这些研究明确了土壤有机质的微生物来源，认为微生物残体是土壤有机质积累的主要驱动因素。此外，从分子结构的角度，NMR实验证据支持了土壤有机质大部分直接来源于微生物残体的观点。早在1981年，基于固相13C-NMR分析土壤有机碳的结果显示，土壤有机质分子以烷基碳为主，而传统认为含量丰富的芳香碳仅占土壤总有机碳的15%~37%，对传统腐殖质芳香结构的认识提出了挑战。随后，利用1H-NMR的研究发现，土壤可提取腐殖质中微生物来源组分的贡献可达50%以上，同时土壤中高于80%的氮来源于微生物。综合多相NMR(CMP-NMR)对原位状态下土壤固液界面有机质分布的分析发现，土壤有机质主要由降解的生物大分子组成，脂和糖类的极性端暴露在土水界面，而木质素和微生物残体位于有机质层的内部。此外，越来越多研究证明，土壤腐殖质并不是稳定不变的，而是受到土壤生物等因素的调控。
分子量及空间聚集形式是土壤有机质的一个重要性质，在一定程度上决定了有机质的移动性和生物稳定性。分子量也是反映土壤有机质本质的重要指标。腐殖化理论认为，土壤有机质通过共价键聚合，形成大分子物质。一般认为有机质分子量大于5000道尔顿(Da)的为大分子。早期以蛋白和多糖为标样，利用葡聚糖凝胶色谱分析发现，土壤80%的胡敏酸分子量在5000~10000 Da之间。利用超滤分离技术，发现黑钙土胡敏酸中只有20%的有机质可以透过5000 Da的滤膜。以聚苯乙烯磺酸钠为标样，利用高效液相-体积排阻色谱(high perfor mance size-exclusion chromatography, HP-SEC)分析发现，日本不同类型土壤胡敏酸的重均分子量在3160~28200 Da之间。类似地，利用折射率检测器分析水稻土、泥炭和沉积物中的胡敏酸，获得重均分子量范围为5899~15533 Da。这些结果表明，腐殖质分子量分布范围较宽，且受环境条件影响巨大。近年来，逐渐意识到色谱分离方法在评估腐殖酸分子量上的局限性，这一方法测定的分子量被称为表观分子量。然而，一些实验证据显示，土壤腐殖酸可能主要由小分子组成。Zeile和Fuchs等人通过测定沸点和扩散系数，较早指出土壤腐殖酸的分子量为1400~1650 Da。在中性pH条件下，利用聚苯乙烯磺酸钠为标样，高效液相-体积排阻色谱分析得到Aldrich胡敏酸的重均分子量为4100 Da。而向腐殖质中添加乙酸则破坏了分子间的氢键，增加了小分子物质的分布，表明腐殖质大分子是由小分子物质通过疏水力和氢键等弱相互作用团聚而成。Myneni等人利用原子力显微镜及X射线扫描透射显微原位观测技术发现，腐殖质的聚集状态受pH及离子强度控制，腐殖酸尺寸随pH和离子强度的增加显著减小，推测腐殖质可能是由较小有机分子聚合而成的产物。同样，利用扫描电子显微镜发现，土壤胡敏酸的聚集度随pH升高而降低，尺寸变小。此外，借助X射线扫描透射显微技术，在50 nm空间分辨率原位观测土壤颗粒表面有机碳的结构及分布，发现土壤有机碳空间分布具有极大的异质性，这从土壤有机质的原位表征方面进一步向土壤腐殖质大分子理论发起了挑战。可见，越来越多的证据支撑了土壤有机质主要由小分子聚合而成，同时存在较大的空间异质性。为了解释小分子团聚现象，有学者提出了“超分子”聚集学说，认为腐殖质大分子是由有机小分子片段通过氢键和疏水相互作用自组装聚集而成。这一理论很好地解释了腐殖质结构随pH/离子强度等条件变化，腐殖质中存在氨基酸片段，以及质谱分析胡敏酸获得大量低分子量物质的现象。近年来，随着氢键理论的发展，逐渐认识到有机分子之间可能存在不同强度的氢键，它们可形成强度接近于共价键的稳定结构。基于有机质小分子理论，SPARC’s和线性自由能模型计算发现，有机质官能团特性与实验分析结果符合。这些实验证据及研究结果为土壤腐殖质是由小分子聚合而成的假说提供了强有力的支撑. 这些不同的有机质理论将对应截然不同的土壤管理方法和目标。
土壤有机质的主体部分是与矿物结合的有机无机复合体，过去对土壤有机质的研究大多基于化学分离提取。常用提取方法中，水仅能提取土壤中不到1%的有机碳。而碱溶液是应用最多且最有效的提取方法，可提取土壤中超过50%的有机质。但是提取过程中氧气会与有机质反应，改变土壤有机质的结构。为了避免碱性条件下的不利反应，中性焦磷酸盐溶液也常用来提取土壤有机质，提取效率约为土壤总有机质的10%~15%。高浓度尿素可进一步破坏分子间氢键，与碱溶液配合，可使有机质的提取效率增加约10%。此外，有机溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺等溶解腐殖质的能力与碱溶液相当，也被用来提取土壤有机质。但是由于有机试剂各自独特的介电常数和偶极矩，导致它们对有机质组分的提取具有偏好性。例如，丙酮主要溶解土壤中的脂肪烃组分。可见，单一试剂不足以充分提取土壤有机质，可能需要应用多种方法的联合，提高土壤有机碳的提取效率。氨基糖生物标志物和高分辨质谱是目前评估土壤有机质来源的主要手段。通过氨基糖标志物法计算获得的土壤微生物来源碳可占总有机碳的33%~62%。而利用质谱则发现土壤胡敏酸主要由木质素类、含羧基的脂环族类与缩合芳香族3种主要分子组成，分别占质谱识别分子数的38%、41%和26%，证明胡敏酸可能主要是植物来源。这两种方法的分歧说明，单一的手段可能不足以准确评估土壤有机质来源。生物标志物法存在转化系数不准确、提取效率低等问题; 质谱方法存在提取效率低、分析不完全的问题。此外，质谱数据解析也可能存在误差，与仅使用碳、氢、氧、氮元素组成相比，在分子式中添加硫元素可以使指定峰的数量增加17%，而磷元素的添加进一步增加了11%的分配峰。多种标志物与高分辨质谱结合的方法, 将能最大程度解析土壤有机质的组成及来源.化学提取破坏了有机质的空间结构，而对土壤颗粒直接表征能获得有机质组成及分布的原位信息。利用综合多相NMR，Simpson课题组分析了土壤固液界面有机质的空间结构，并提出了立体的分子排列模型。然而，这一技术仅能获取土壤颗粒垂直方向上有机质分布的平均信息。扫描透射X射线显微结合近边结构展示了土壤层状硅酸盐矿物、铁铝氧化物、Ca等矿质组分与有机分子在数十纳米空间分辨下的分布规律。结果发现，草地土壤中铁氧化物和层状硅酸盐矿物对有机碳固定起着同等重要的作用，而Ca与有机碳分布的相关性最强。NanoSIMS具有相似的空间分辨率，结合同位素示踪可进一步区分土壤表面新鲜输入的碳、氮等元素. 该技术发现淋溶土中被有机碳覆盖的矿物表面低于19%，来源于秸秆的新碳优先固定在矿物-有机复合体上，而土壤中新形成的含氮化合物则优先与矿物结合。但是，这些技术的空间分辨率仍然有限，不能获取有机质单分子的信息；此外，受机时限制，也没有广泛应用于土壤有机质的研究。当前土壤有机质的来源、结构和稳定性等重大科学问题仍未得到充分解决。土壤有机质，尤其是难以提取部分有机质的分子量大小仍不清楚；植物、微生物等不同来源有机质在土壤中的相对比例有待量化；土壤生物、非生物过程对有机质形成和稳定的贡献还不明确；原位条件下有机质的时空分布特征及其稳定性还缺乏实验证据。未来应加强以下几个方面的研究。(1) 改进和完善土壤有机质提取方法。土壤有机质高效提取结合高分辨质谱，有望最终揭示土壤有机质分子量及分子组成。(2) 多方法联合解析土壤有机质分子量及聚合方式。(3) 量化植物、微生物残体等对土壤有机质积累的贡献。目前土壤有机质来源的定量分析主要根据土壤氨基糖和木质素酚含量，结合植物、细菌和真菌体内相应物质的比例，按照简单的换算系数获得。标志物的提取效率、不同类型生物分子周转时间的差异，以及土壤微生物群落组成均会影响结果的准确性。未来，一方面需要加强现有生物标志物方法的研究，通过提高标志物的提取效率、明确不同类型生物分子的周转速率, 以获取准确的转化系数，提高方法的可靠性。另一方面，需要通过氨基糖、木质素酚、脂类、蛋白、DNA和中性糖等多种标志物同步分析，生物标志物-质谱技术联合表征，在尽可能查清不同类型有机分子来源的条件下, 综合研判、准确评估土壤有机质微生物、植物等不同来源的相对贡献。同时，在不同生态系统和尺度下，利用生物标志物、宏基因组等研究手段，量化不同类型土壤生物，如微生物、病毒、土壤动物及其互作网络在有机质转化、积累中的作用和贡献。最终破解土壤有机质植物与微生物起源之争。(4) 发展高空间及化学分辨原位表征技术。近年来对土壤有机质的新认知很大一部分来源于空间分辨50 nm左右的扫描透射X射线显微及近边结构技术。这一技术可以获得土壤颗粒中植物、微生物残体、黑炭等不同类型有机质的斑块状分布特征，但是仍不能回答单分子尺度下矿物表面有机质吸附的结构，以及有机-有机分子之间的聚合机制。原子力-红外、冷冻电子显微镜-电子能量损失谱技术可在亚纳米、纳米空间分辨下同时采集形貌和矿物-有机质组成的化学信息。目前这些原位分析方法的应用还较少, 尤其缺乏原位条件下土壤矿物表面有机碳结构及分布的实验研究. 这些原位显微技术的应用有望进一步揭示土壤有机质的空间分布及化学结构。(5) 加强土壤组分互作耦合界面有机质动态过程研究。土壤有机质的积累是在植物、微生物、矿物多种因素共同作用下完成的。尤其是氧化还原界面上, 活性铁、锰氧化铁的催化作用，自由基对有机质的分解和聚合有着不可忽视的影响。仅通过对土壤有机质及有机-矿物复合体的表征，并不能很好地回答有机质形成过程及不同因子对有机碳积累的贡献。未来应重点考察活性矿物-微生物多组分界面互作对有机碳合成、分解以及生物-非生物聚合等过程的影响. 发展多组分互作界面实时观测技术, 如微流控和土壤芯片技术, 揭示土壤活性矿物-有机质-微生物耦合界面有机质的分解及固定机制。
