农资头条Project planning

枯草芽孢杆菌制剂中有效活菌数测定的能力验证

来源:马东,李可然,王秀丽(天津坤禾生物科技集团股份有限公司) 时间:2020年09月02日

分享: 标签: 枯草芽孢杆菌制剂中有效活菌数测定的能力验证

摘要:枯草芽孢杆菌制剂中有效活菌数测定的能力验证

作者:马东,李可然,王秀丽(天津坤禾生物科技集团股份有限公司)

摘要:为了提高实验室对枯草芽孢杆菌制剂中有效活菌数的检测能力,我们以《能力验证提供者认可准则在微生物领域的应用说明》(CNAS-CL03-A001:2018)为依据进行本次能力验证试验。按照《农用微生物菌剂》(GB 20287-2006)、《微生物肥料产品检验规程》(NY/T 2321-2013)对样品进行检测。结果显示,满意结果占反馈结果总数的83.3%。

关键词:枯草芽孢杆菌;有效活菌数;能力验证

ABSTRACT: In order to improve the laboratory's ability in testing viable bacteria number of the bacillus subtilis products, we have organized this proficiency test based on Guidelines for the Validation of Providers in the Microbiology (CNAS-CL03-A001:2018). The samples were tested according to Agricultural Microbial Inoculants (GB 20287-2006) and Microbial Fertilizer Products Inspection Regulations (NY/T 2321-2013). The results showed that satisfactory results accounted for 83.3% of the total.

KEY WORDS: Proficiency Testing; Viable Number of Functional Microorganism; Bacillus subtilis

1 引言

能力验证是指利用实验室间比对,按照预先制定的准则来评价参加者的能力[1]。能力验证作为一种重要的质量控制手段,可以发现实验室的检验结果与同行间的差异,因而在检测领域接受度较高且已得到广泛应用。

近年来,随着发酵行业的快速发展以及发酵水平的不断提高,实验室亟需对高含量有效活菌数的检测能力进行验证。然而,中国合格评定国家认可委员会(CNAS)暂未展开高含量有效活菌数的检测能力验证计划,文献亦未见相关报道。

因此,本文对高含量枯草芽孢杆菌(50亿/mL水平)中有效活菌数检测的能力验证进行研究,以期推动完善能力验证在该领域的应用。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

表1 实验仪器

表2 实验试剂

2.2 样品制备

取库存50亿枯草芽孢杆菌制剂成品,搅拌(转速为:600 rpm)6小时,分装到西林瓶中,每瓶100 mL,共50瓶样品,编号。

2.3 样品的均匀性与稳定性检验

按照《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》(CNAS-GL003:2018 )[2]、《能力验证提供者认可准则在微生物领域的应用说明》(CNAS-CL03-A001:2018)[3]的要求进行。

2.3.1 样品均匀性

从总体样品中随机抽取10个样品进行均匀性检验,每个样品在相同条件下重复测试两次。将测试数据转换为以10为底的对数值后进行均匀性评价。以单因子方差分析(F检验)作为样品发送前初步评价均匀性的方法,通过F检验后方可发送样品。待参加者数据返回后,获得σ时,再利用Ss≤0.3σ准则确认样品是否均匀[4]。

2.3.2 样品稳定性

从总体样品中随机抽取5个进行稳定性检验,将其均匀性检验数据作为稳定性检验的第一次测试数据。模拟运输条件放置60天后,进行第二次测试。每个样品在相同条件下重复测试两次。以t检验作为样品发送前初步评价稳定性的方法,通过t检验后方可发送样品。待参加者数据返回后,获得σ时,再利用准则确认样品是否稳定[4]。

2.4 检测方法

实验样品均按照《农用微生物菌剂》(GB 20287-2006)[5]、《微生物肥料产品检验规程》(NY/T 2321-2013)[6]进行检测。

2.5 统计与评价方法

对参试者的检测结果经过对数转换后,按下式计算z值:

Z=(x-X)∕σ

式中:x-参加者检测结果;X-指定值;σ-能力评定标准差。

按照CNAS-GL002:2018《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》[7]附录A中算法A确定指定值和能力评定标准差,即采用稳健平均值作为指定值,采用稳健标准差作为能力评定标准差。

依据CNAS-CL03-A001:2018《能力验证提供者认可准则在微生物领域的应用说明》,以Z值评价参加者的结果,见表3。

表3 CNAS标准评价准则

3 结果与讨论

3.1 参加实验室情况

本次能力验证共有18个实验室参加并反馈结果,主要包括生产企业和第三方检测机构。

3.2 能力验证样品的均匀性和稳定性检验结果

3.2.1 均匀性检验结果及分析

样品均匀性检验统计分析结果见表4,结果表明:样品间无显著性差异,样品具有良好的均匀性。

表4 样品均匀性检验统计分析结果

3.2.2 稳定性检验结果及分析

样品稳定性检验统计分析结果见表5,结果表明:样品在测试期间是稳定的,能够满足能力验证样品的要求。

表5 样品稳定性检验统计分析结果

3.3 检测结果和数理统计

3.3.1 统计量

按照CNAS-GL002:2018《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》附录A中算法A确定指定值和能力评定标准差。确定指定值为:9.672,能力评定标准差为:0.0546。

3.3.2 统计结果

将Z值按大小顺序排列作柱状图(如图1所示),图上标有参加者的代码,通过该图每个参与者均可将其结果与其他参与者的结果进行比较,从而了解其结果在本计划中所处的水平。

图1 参试者检测结果Z比百分数柱状图

根据《能力验证提供者认可准则在微生物领域的应用说明》(CNAS-CL03-A001:2018)将本次能力验证结果进行统计分析,见表6。

表6 能力验证结果评价表


3.4 技术分析

样品均匀性和稳定性实验结果表明,样品间无显著性差异,且在测试期间可稳定储存、运输,能够满足能力验证样品的要求。样品差异对参加者反馈结果无明显影响。造成有问题结果、不满意结果的原因可能如下:

1)检测标准相对滞后

随着微生物制剂生产工艺的不断完善,产品中的微生物浓度也不断攀升,含量已达千亿水平,而检测标准相对滞后,两个检测依据的标准年代号分别为2006和2013。

2)母液浓度问题

《农用微生物菌剂》(GB 20287-2006)、《微生物肥料产品检验规程》(NY/T 2321-2013)中,1:10母液的制备为10 g加入100 mL无菌水中,不是严格意义上的1:10。部分参试者采用25 g加入225 mL无菌水中。

3)梯度稀释问题

部分参试者每根管未准确移9 mL无菌水,而是采用移好的9 mL水灭菌后直接使用(灭菌过程中水会有部分损失);试管未充分振荡均匀;混合后如没有及时进行下一梯度的稀释,可能造成菌的沉降。

4)平板中菌落数量的控制

在完全混合的菌悬液中,平板中形成的菌落数服从统计学中的泊松分布,平板中菌落数越多,计算的菌落数在95%的置信区间越窄,数据越接近真实值。但是当一个平板中菌落数大于300时,难于计数,而且由于菌量过高,菌体之间对营养的竞争造成菌落很小,甚至有些菌体无法形成菌落。因此,从统计学和微生物学的意义上,一般可接受的一个平板上形成菌落数为30-300个[8]。

《农用微生物菌剂》(GB 20287-2006)、《微生物肥料产品检验规程》(NY/T 2321-2013)检测,要求以出现20~300个菌落数的稀释度的平板为技术标准。

因此,实际检测过程中,建议菌落数控制在30~150个。在此范围内,基本形成单菌落且无重叠现象,计数误差小,重现性高。

5)培养基问题

无论自配培养基还是商品培养基,均应通过培养基适用性检查,方可选用。

4 结论

本文首次报道了高含量有效活菌数的检测能力验证计划,推动完善能力验证在该领域的应用。本次能力验证按|z|≤2.0评定,满意率为83.3%,表明大部分参试者具备高含量有效活菌数的检测能力,客观反映了参试者的检测水平。对于不满意结果的参试者,应积极查找原因,采取措施,以保证日常检测结果的准确、可靠。

参考文献

[1] 中国合格评定国家认可委员会. CNAS-RL02:2018 能力验证规则[S].

[2] 中国合格评定国家认可委员会. CNAS-GL003:2018 能力验证样品均匀性和稳定性评价指南[S].

[3] 中国合格评定国家认可委员会. CNAS-CL03-A001:2018 能力验证提供者认可准则在微生物领域的应用说明[S].

[4] 戴雪伟, 姜瀛洲, 王璐. 能力验证均匀性检验的两种统计分析方法比较及结果合理性判断[J]. 检验检疫学刊, 2014, 5: 28-31.

[5] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. GB 20287-2006 农用微生物菌剂[S].

[6] 中华人民共和国农业部. NY/T 2321-2013 微生物肥料产品检验规程[S].

[7] 中国合格评定国家认可委员会. CNAS-GL002:2018 能力验证结果的统计处理和能力评价指南[S].

[8] 路福平. 微生物学[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2015: 327.



更多农资快讯!欢迎扫描下方二维码关注农资农资与市场APP。

  • 编辑:《农资与市场》杂志社

下一条:我们为什么要提出经作可持续种植的倡议?

上一条:川渝柑橘产业2020线下规模盛会,相约四川·眉山(附会议流程)

最新评论刷新

推荐专题
独家观察:水稻区统防统治的来路与去路
如何完成从把农资卖到种植户手里向帮种植户施到田里的转型,应该是农资人必须考虑的问题。转型需求之下,专业化统防统治服务是有效途径。统防统治一定是未来的趋势,未来正在来,首先要做好当下。那么,当下做好统防统治的关键点是什么?
[ 查看详细 ]
云南“诱惑”:被“蚕食”的农资“大蛋糕”
“为什么全国的农资企业全面进军云南市场?、为什么云南农资市场现在如此火爆?、为什么昆明会聚集上千家省级销售平台?为什么特肥在这个地方如此受欢迎?以及为什么有些企业的业务员到了昆明以后摇身一变成了省级经销商?
[ 查看详细 ]